JUDUL : GEL ELEKTROFORESIS DAN APLIKASINYA
PENGARANG : Pulimamidi
Rabindra Reddy dan Nomula Raju
Departemen Kimia, Universitas Osmania, Hyderabad,
India
Departemen Kimia, Universitas Osmania, Hyderabad,
India
RESUME
LATAR BELAKANG :
Elektroforesis
menerapkan prinsip pemisahan molekul bermuatan dalam suatu medan listrik. Jika
ditempatkan dalam medan listrik, muatan negatif dan positif suatu biomolekul
bergerak menuju elektroda yang berlawanan karena adanya gaya tarik-menarik
elektrostatik. Elektroforesis bergantung pada persamaan v = E.q / f, dengan E adalah kekuatan medan listrik, q muatan total
pada molekul dan f adalah koefisien gesekan. Menurut persamaan ini, molekul
akan bergerak lebih cepat apabila
muatannnya diperbesar, muatan listrik diperkuat dan f menurun. Molekul muatan yang sama
terpisahkan karena perbedaan koefisien gesek sementara molekul dengan massa/bentuk yang sama mungkin sangat
berbeda satu sama lain dalam hal muatannya. Sehingga campuran yang kompleks
mungkin dipisahkan mencapai resolusi yang tinggi dengan proses elektroforesis.
MANFAAT :
Gel agarosa teknik elektroforesis banyak
digunakan untuk menyelidiki efisiensi pembelahan molekul kecil dan mempelajari
pola pembelahan DNA. Teknik dengan menggunakan gel agarosa ini dapat digunakan
untuk mendesain sebuah obat. Pembelahan DNA yang terjadi juga digunakan untuk
menghitung laju hidrolisis.
METODE :
Metode
elektroforesis ini menggunakan gel karena gel secara kimiawi lebih tidak aktif,
mereka sedikit
berinteraksi dengan biomolekul selama elektroforesis sehingga memungkinkan
pemisahan berdasarkan fisik daripada perbedaan kimia antara komponen sampel.
Material yang sering digunakan dalam pemisahan asam nukleat dan protein adalah
gel agarosa dan gel akrilamida. Gel agarosa adalah gel yang paling umum
digunakan saat ini. Agarosa menghasilkan derajat yang lebih seragam daripada
pati dan dapat bervariasi dengan mengubah konsentrasi mulai dari
suspensi(konsentrasi rendah mengubah pori-pori menjadi besar, sementara
konsentrasi tinggi mengubah pori-pori menjadi kecil). Karena distribusi muatan
seragam dalam asam nukleat, untuk menentukan massa molekul DNA cukup akurat
berdasarkan mobilitas pada gel agarose. Akrilamida
adalah sebuah gel yang lebih tepat untuk pemisahan elektroforesis dari kedua
protein dan asam nukleat. Untuk pemisahan protein, rasio akrilamida: N, metilen
bis akrilamida N ' biasanya 40:1 sedangkan untuk pemisahan DNA adalah 19:01.
Gel tersebut cocok untuk pemisahan DNA resolusi tinggi dan protein. Alat-alat
yang digunakan adalah electrophoresis chamber(kotak elektroforesis), power
supply, gel pengecoran nampan yang
tersedia dalam berbagai ukuran dan terdiri dari plastik UV transparan, sisir untuk membentuk
sumur-sumur sampel pada gel, buffer elektroforesis(penyangga) seperti
Tris-acetate-EDTA (TAE) atau Tris-borate-EDTA (TBE), Transilluminator(kotak sinar ultraviolet), yang digunakan untuk memvisualisasikan
DNA bernoda pada gel. CATATAN: selalu memakai kacamata pelindung ketika
mengamati DNA pada Transilluminator untuk mencegah kerusakan mata dari sinar UV.
CARA KERJA :
1.
Mempersiapkan gel. Agarosa bubuk dicampur dengan buffer elektroforesis sesuai konsentrasi
yang diinginkan kemudian dipanaskan dalam oven untuk mencairkannya. Etidium
bromida ditambahkan ke gel (konsentrasi akhir 0,5 ug / ml) untuk memfasilitasi
visualisasi DNA setelah elektroforesis.
2. Setelah larutan
didinginkan sampai dengan 60°C, larutan dituangkan
ke nampan pengecoran yang mengandung sisir sampel dan didiamkan pada suhu
kamar.
3. Setelah gel telah
dipadatkan, sisir diambil dengan hati-hati jangan sampai merobek bagian bawah sumur.
4. Gel yang masih berada
dalam plastic tray, dimasukkan secara horizontal ke kotak elektroforesis dan
ditutupi dengan buffer.
5. Sampel yang
mengandung DNA dicampur dengan loading buffer kemudian dipipet ke dalam sumur
sampel, penutup dan power supply ditempatkan pada alat.
6. Arus diberikan.
7. Aliran arus dikonfirmasi
dengan mengamati gelembung dari elektroda. DNA akan bermigrasi ke arah
elektroda positif, yang biasanya berwarna merah.
8. DNA yang telah bermigrasi
dalam gel dapat pantau dengan visual sesuai pewarnaan jejak DNA oleh biru
bromofenol dan pewarna cyanol xylene.
9. Konsentrasi gel
agarosa yang berbeda, dapat mengatasi berbagai ukuran fragmen DNA.
